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32 利用高分辨率的CMA芯片进行染色体疾病诊断时对于检测到的拷贝数重复临床意义阐述的操作指南
发布日期:2012-12-12 15:51:53 来源:北京博尔诚医学检验所

文章出处European Journal of Human Genetics,2012,20:161-165,

SCI影响因子4.4002011年)

文章链接http://www.nature.com/ejhg/journal/v20/n2/full/ejhg2011174a.html

研究背景:基因组规模的染色体芯片(CMA芯片)可以检测到小至几个kb的染色体拷贝数变异(CNV)。利用CMA芯片,可以在发育迟缓和先天性多种体征畸形的患者里面可以较常规的核型分析和MLPA方法多检出15%的阳性病人。但是,关于CNVs临床意义阐述的发展远落后于芯片分辨率的发展,大量出现的CNVS和临床表型的不确定性阻碍了芯片结果在病人中临床意义的正确阐述。并且,阐述CNVS的重复较CNVS的缺失更加复杂。通常认为微重复对表型的影响相对较小并且在个体中变化大。并且关于基因剂量的增加较基因剂量的减少引起的功能改变方面我们了解得更少。

通常认为新发的CNVS通常致病,而家族遗传性的CNVS通常不致病,这种认识并不总是正确。已经有研究表明遗传的CNVS可以导致临床症状,以及新发的CNV并不致病的报道。确定一段CNVS是否具有临床意义更可靠的方法是把该CNV和大规模正常人群的CNV数据库进行比较,例如Genomic Variant DGV)数据库就是这样的(http://projects.tcag.ca/variation 一个主要的数据库。

这篇文章针对300名发育迟缓和多种体征畸形的患者,对CMA芯片检出大于一定阈值的CNV重复进行了实际判读的指导。然后在另外一组300名发育迟缓和多种体征畸形的患者再次评估guideline的可行性。

病人资料和方法

第一批300名病人都出现了发育迟缓、行为障碍或者体征畸形。这些患者的父母都没有出现患者的临床症状,父母样本只要有可能也进行CMA芯片分析。第二批300名患者也是具有发育迟缓、体征畸形的特征,用于评估指南的可行性。

正常健康人的数据第一批来自300人,包括患者正常的父母,在第二阶段的时候,超过700人。

CMA芯片来源

这里用的CMA芯片,是Oxford公司在Agilent定制的105KOigo aCGH芯片。判读重复片段是至少连续4条探针都出现了Log值大于0.4的数值。并且大于10Mb片段的重复不被认为是微重复而没有进入到该指南分析。

阐述片段重复的流程

阐述流程部分建立在以前发表过的研究上,但不把片段来源和片段大小作为阐述流程的标准。在本文中,健康人CNV多态性数据库包括两个,一个是Low Lands consortium reference数据库,在第一阶段,该数据库包括300个健康父母的CNV数据;第二阶段的时候,有超过700名的健康人CNV数据。第二个数据库就是DGV数据库,里面包括多个人的测序结果。

阐述微重复的临床意义遵循以下步骤:

步骤一: 先与Low Lands consortium reference database进行比较。因为在该数据库中包括了一些病人的健康父母的aCGH数据,所以若重复片段的次数在该数据库中出现了4次以上(通常设定的3次,即占整个数据库案例的1%),则该片段重复被认为是良性的多态性片段。另外一方面与其相对应的缺失出现在数据库中次数大于等于3次(对照组为300时)或大于等于5次(对照组为700时),则该区域出现的重复也被认为是良性的。

步骤二:和DVG(the Database of Genomic Variants)的数据库比较,若该数据库中出现的片段重复次数达到3次,或者重复次数达到两次并且对应区域出现过5次以上的缺失,则也被考虑为良性的多态性片段;

步骤三:和已知的染色体综合征数据库比较,主要是Decipher数据库,若一段片段的重复已经在Decipher数据库中被描述是致病性的,并且病人的临床症状和数据库中的描述吻合,则可以明确该片段的重复是致病性的;

步骤四:对于剩余的重复片段,可以查找Genatlas(http://genatals.medicine.univ-paris5.fr)USCS数据库(http://genome.uscs.edu)来看该重复片段上所包含的基因。若重复片段上没有基因,或者所包含的基因功能和临床症状没有关系,则可以考虑该片段的重复是良性的。

步骤五:对于仍然剩余的重复片段,也就是该重复片段上包含与临床症状可能相关的基因,或者功能尚不明确的基因,则在Pubmed,Embase,Decipher,ECARUCA数据库中查找与该重复片段交叉的类似案例报道。若在该重复片段相同区域或者更宽广的重复区域有临床症状类似的报道,则该重复是临床致病性的;若没有和该重复片段交叉,或者即使交叉,但临床症状不同的案例出现,则认为该片段的重复是临床意义尚未明确的片段。

因此,对于CMA芯片检测出的微重复的会有三种临床结果:具有临床意义的;临床意思尚未清楚的;良性的CNV

结果

在第一批300个病人中对重复片段的阐述

在第一批300个病人中,一共发现了805个重复片段,通过排除一些大片段、Y染色体上的假常染色体区域等,最终分析的有797个重复片段,分布在287个不同的病人中,只有13个病人没有检查到任何重复片段。

在这797个片段中,有546个(68.5%)重复是良性的多态性,因为这些片段在含有病人健康父母的CNV数据库中都存在。在剩余的251个重复片段中,又有151个片段属于良性多态性(60.2%),这些片段在正常人的DGV数据库中存在。有8个重复片段已经在Decipher数据库中明确是致病性的。然后根据所发表的文献,以及片段上的基因含量,可以确定29个重复片段是多态性,有7个片段是有临床致病性的。

最终,有726个重复片段是良性多态性(91.1%)15个片段是临床致病性的(1.9%)56个片段(7.0%)是临床意义尚不能确认的。

在第一批300个病人中评估重复片段的起源

在第一批300个病人发现的797个重复片段中,有508个片段(63.7%)由于同时检查了患儿和父母,因此是可以评估重复片段的来源。这508个片段中,230个(45%)是新发的,278个(55%)是遗传的。遗传来源的略微多于新发的变异。在15临床致病性的片段中,有14个可以明确其来源。这14个致病性片段中,有10个是遗传性的(71%),新发的有4个(29%)。因此在致病性的重复片段中,遗传的明显多于新发的。而正常多态性的片段中,遗传的和新发的差不多(前者242/460,53%;后者218/460; 47%)

在第一批病人中变异片段大小引起的不同临床意义

临床致病性的重复片段平均是2283Kb(范围从288-7912Kb),而良性多态性和临床意义尚不确认的片段大小明显偏小。

若把200Kb作为一个门槛,18个临床意义尚未明确片段,以及436个良性多态性片段都能检查到。在这个阈值上,84.5% (290/343)个片段是良性多态性。把阈值上调到300,400,500kb,几乎不影响分析的特异性,但会降低分析的灵敏度。

在第二批病人中评估分析流程。

在第二批300个病人中,当用大于200kb的阈值进修分析时,发现有598个重复片段,其中506个片段是良性多态性(85.2%,72个片段是临床意思尚不明确片段(12.1%),16个片段是致病性的(2.7%)。在16个片段中,12个病人片段变异可以追溯来源,其中6个是家庭遗传性,6个是新发的。数据和第一批病人类似。

讨论

1、该研究发现一位患者在DMD基因片段上有253Kb的重复,但是患者并没有表现出DMD患者的临床症状。后来通过FISH发现,DMD所在区域Xp21.1的重复,实际是插入到了Xq27,因此并没有破坏DMD基因的功能。因此文章建议若发现在基因内部片段出现的重复需要用FISH进行确认才能下临床结论。

2、建议针对重复片段临床意义分析可以设置200kb的片段大小作为分析的阈值。

3、对于从父母遗传来的重复片段不要排除临床致病的可能性。在以前的假设中一直存在争论,认为若是新发的CNV变异往往是致病性的。在本研究中发现,有94.8% (218/230)的新发重复片段都是良性多态性。而反之,明确临床意义的26个片段中,有16个是遗传来的(61.5%)。已经有文献表明,有一些微重复综合征在不同的人群中表现出很大不同意义的临床症状,并且经常遗传自没有临床症状或者临床症状表型不明显的父母。其中有5个患儿(32女)的症状来自X染色体的重复,例如有两名男孩患儿遗传了来自母亲的Xq28重复,但母亲没有任何症状。


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