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42 定制叠瓦状aCGH芯片检测地中海贫血患者中α-珠蛋白和β-珠蛋白基因簇的微缺失
发布日期:2013-1-7 16:22:36 来源:北京博尔诚医学检验所

文章出处Hum Mutat. 2012;33(1):272-80.

SCI影响因子5.686

文章链接http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/humu.21612/pdf

研究背景地中海贫血β-globin珠蛋白基因(HBB),或者α-globin珠蛋白基因(HBA1 and HBA2)基因表达缺失或者降低。8090%的α-地贫是由于位于16p13.3位置的α-globin珠蛋白基因簇的片段缺失;而β-地贫位于11p15.4位置的β-globin珠蛋白大多数为点突变,只有10%是缺失突变。目前已经发现有超过70种的α-globin珠蛋白缺失突变;60β-globin珠蛋白缺失突变。检测缺失突变的方法主要有Southern blotFISH探针和Gap-PCR.前两种方法都取决于先需要制备探针,费时费力并且分辨率低(>2Mb),不适合进行常规的临床诊断;Gap-PCR通过在缺失片段两端设计PCR引物,然后通过PCR产物的电泳来判断缺失情况,只能检测已知缺失发生位置的突变。最近有利用MLPA方法来检测地贫基因突变,并发现了一些新的缺失突变形式;但是MLPA方法不能确定缺失突变中具体断裂点发生的位置,因此确定了新发缺失突变的断裂点所在后,就能通过Gap-PCR的方法来做常规临床检测了。aCGH芯片技术,具有分辨率高、操作简单、重复性好等特点,非常适合来寻找基因组DNA上所发生缺失的断裂点位置所在。从已有的研究看,定制叠瓦状的aCGH芯片已经成功用于检测NF1BRCA1MECP2GJB2GJB6STK11基因中发生的微小缺失。在本研究中,研究者设计了一款覆盖α-珠蛋白和β-珠蛋白基因簇的叠瓦状aCGH芯片,来找地贫缺失突变中具体断裂点所在位置。

材料和方法:一共选了36个地贫患者,其中9DNA样本是已知缺失断裂点的,来测试aCGH芯片的性能;另外27个样本是经过MLPA检出有缺失突变,需要确定断裂点的。芯片设计后采用NimbleGen的无掩膜微镜光原位合成技术合成芯片,扫描仪采用Agilent的芯片扫描系统。在aCGH芯片确定断裂点后,然后在断裂点两端设计PCR引物进行扩增,再对PCR产物进行测序以确定断裂点的基因序列。aCGH芯片上有13.5万条探针,可以检出20bp的微小缺失。

结果和讨论:所有36DNA样本,aCGHMLPA的结果都吻合。然后根据aCGH的结果,27个尚不明确断裂点的样本中,有22个样本能设计Gap-PCR的引物,有19个能成功得到Gap-PCR的结果,然后其中12PCR产物通过测序得到了具体的断裂点。另外7个由于PCR产物中有重复序列出现而测序失败,表明缺失的片段中含有重复序列。在一些样本,报告健康对照样本中,aCGH芯片也发现了5Kb的重复,以及7.5Kb的缺失,这些区域没有包含基因。鉴于健康对照在这些区域上有存在染色体拷贝数变异(CNVs),因此这些CNVs被认为是多态性而不被进一步考虑。

 

aCGH芯片检出的地贫基因各种微小缺失突变


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